產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號	規(guī)格	有效期
EdU染色試劑盒（綠，AF488）	HKI0021	100T	一年

【產(chǎn)品簡介】
EdU(5-ethynyl-2′-deoxyuridine)，中文名為 5-乙炔基-2′-脫氧尿苷，是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其炔羥基團在天然化合物中很少見，在細胞增殖時能夠替代胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷，thymidine) 插入正在復(fù)制的DNA分子中，EdU上的乙炔基能與熒光標記的小分子疊氮化物探針(如AzideAlexaFluor488等)通過一價銅離子催化發(fā)生共價反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應(yīng)非常迅速，被稱作點擊反應(yīng)(Clickreaction)，從而可以進行高效快速的檢測細胞增殖，特別是可以有效地檢測處于S期的細胞百分數(shù)。與傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測方法相比，EdU只有BrdU抗體大小的1/500，在細胞內(nèi)更容易擴散，不需要嚴格的樣品變性(酸解、熱解、酶解)處理，有效地避免了樣品損傷，有助于在組織、器官的整體水平上觀測細胞增殖的真實情況，具有更高的靈敏度和更快的檢測速度。

【儲存與運輸】
冰袋運輸，-20?C?儲存，可穩(wěn)定儲存一年

【試劑組成】

貨號	品名	規(guī)格
HKI0021-1	反應(yīng)緩沖液PB	5ml
HKI0021-2	催化劑AC	1ml
HKI0021-3	催化劑CU	200ul
HKI0021-4	綠色色原	25ul
HKI0021-5	EdU儲存液（10mM）	50ul

【使用方法】

動物EdU注射

對于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動物的種類、體重和使用方式有關(guān)，可以參考相關(guān)文獻，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索，或者直接使50mg/kg的濃度進行測試。

注射方式:依據(jù)客戶實驗而定，如腹腔注射，皮下注射，肌肉注射，尾靜脈注射等，其中以腹腔注射為多。6小時后或根據(jù)特定實驗確定適當?shù)臅r間后，快速處死小鼠，取出所需組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標記的時候也可參考相關(guān)文獻自行調(diào)整。

建議任何實驗均可取小腸組織檢測細胞增殖情況，小腸上皮組織細胞增殖快，成年小鼠EdU注射6小時后即可檢測到陽性信息，可用作陽性對照進行預(yù)實驗。

切片處理

切片前處理：組織器官最好進行清洗，以去除血液、組織中殘留的EdU，降低背景。

切片厚度：3-10μm為宜，切片過厚可能會影響切片背景及染色效率。

切片后處理：

石蠟切片脫蠟：二甲苯脫蠟2次，15分鐘/次，梯度乙醇（100%，95%，85%，75%）各一次，5分鐘/次，去離子水洗脫1次。

冰凍切片處理：室溫放置30分鐘后，固定10分鐘，PBS清洗3次，每次5分鐘。

細胞實驗

細胞 EdU標記

用細胞完全培養(yǎng)基和EdU母液按8000：1的比例稀釋，制備適量50μM的EdU培養(yǎng)基；

每孔加入適量50μM的EdU培養(yǎng)基孵育2小時，棄培養(yǎng)基（最佳孵育時間一般為細胞周期的1/10）,PBS清洗細胞3次，每次5分鐘，EdU培養(yǎng)基和EdU反應(yīng)液孵育體積可參考下表；

	96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板	5.5cm小皿
EdU培養(yǎng)基	100μL	200μL	300μL	500μL	1mL	2mL
EdU反應(yīng)液	100μL	200μL	300μL	500μL	1mL	2mL

細胞固定通透

每孔加入細胞固定液（含4%的多聚甲醛的PBS）室溫孵育15分鐘，棄固定液，PBS 清洗3次，每次5分鐘；

每孔加入滲透劑(0.5%TritonX-100 的 PBS)脫色搖床孵育15分鐘；PBS 清洗3次，每次5分鐘。

Edu反應(yīng)

按照PB：CU：AC：色原=860：40：100：5的比列配制EdU反應(yīng)液（反應(yīng)液現(xiàn)配現(xiàn)用）。

每個樣本滴加50-100μL的EdU染色反應(yīng)液（反應(yīng)液均勻覆蓋樣本），室溫避光孵育15-60分鐘，棄染色反應(yīng)液，PBS沖洗3次，每次5分鐘。

DAPI染色

每片組織加入50-100ul DAPI染色液，染色15分鐘，PBS洗脫三次，每次5分鐘。

圖像拍照

染色完成后建議立刻觀察，使用熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡或者全片掃描儀進行采集圖像，染色完玻片避光4℃保存。

實驗前須知

EdU 的分子量為 252.23，易溶于水、PBS、生理鹽水。對于動物實驗，如使用自備EdU粉末，建議將 EdU 粉末溶解于DMSO配制成 100mg/ml的母液。EdU建議初始給藥量為50mg/kg（50μg/g），稀釋濃度為 0.5~1mg/mL。小鼠體重20g，需要注射1mg，以1mg/mL計算，需要注射1mL。

Edu	0.1mg	1mg	2mg	10mg
PBS	100μL	1mL	2mL	10mL

對于細胞實驗，EdU母液質(zhì)量濃度為100mg/mL，轉(zhuǎn)化為物質(zhì)的量濃度為400mM，待使用時用細胞完全培養(yǎng)基和EdU母液按8000：1的比例稀釋，制備適量50μM的EdU培養(yǎng)基（50μM為推薦濃度。由于細胞類型、培養(yǎng)基種類、細胞密度和增殖速度等多種因素會顯著影響EdU在細胞中的摻入量。因此，在首次使用EdU時，建議對其使用濃度進行一些探索和調(diào)整。如果您之前已經(jīng)使用BrdU進行過實驗，可以將BrdU的終濃度作為EdU的參考濃度）。

【注意事項】

1. 對于體外培養(yǎng)細胞，具體 EdU 使用濃度、孵育時間隨樣品以及研究目的的不同，可進行 適當調(diào)整。

2. 部分組織細胞增殖速度緩慢，為了排除造模效果不佳等因素，建議選增殖快的組織樣品作 為參照樣本 (如腸道組織)。

3. 如果背景顏色過深，可能是實驗中洗滌不充分、組織樣品固定時間過長、固定液殘余導(dǎo)致。

4. 催化劑 AC 顏色發(fā)生輕微變化，點擊反應(yīng)催化體系依舊能夠正常進行，如呈現(xiàn)棕色，表明 該組分已失效，請棄用。

5. 操作時請穿實驗服，佩戴一次性手套。