產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號(hào)	規(guī)格	有效期
EdU染色試劑盒（粉，AF647）	HKI0023	100T	一年

【產(chǎn)品簡(jiǎn)介】
EdU(5-ethynyl-2′-deoxyuridine)，中文名為 5-乙炔基-2′-脫氧尿苷，是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其炔羥基團(tuán)在天然化合物中很少見，在細(xì)胞增殖時(shí)能夠替代胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷，thymidine) 插入正在復(fù)制的DNA分子中，EdU上的乙炔基能與熒光標(biāo)記的小分子疊氮化物探針(如AzideAlexaFluor488等)通過一價(jià)銅離子催化發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應(yīng)非常迅速，被稱作點(diǎn)擊反應(yīng)(Clickreaction)，從而可以進(jìn)行高效快速的檢測(cè)細(xì)胞增殖，特別是可以有效地檢測(cè)處于S期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。與傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測(cè)方法相比，EdU只有BrdU抗體大小的1/500，在細(xì)胞內(nèi)更容易擴(kuò)散，不需要嚴(yán)格的樣品變性(酸解、熱解、酶解)處理，有效地避免了樣品損傷，有助于在組織、器官的整體水平上觀測(cè)細(xì)胞增殖的真實(shí)情況，具有更高的靈敏度和更快的檢測(cè)速度。
【儲(chǔ)存與運(yùn)輸】
冰袋運(yùn)輸，-20?C?儲(chǔ)存，可穩(wěn)定儲(chǔ)存一年

【試劑組成】

動(dòng)物EdU注射

對(duì)于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動(dòng)物的種類、體重和使用方式有關(guān)，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)，因此初次使用時(shí)建議對(duì)EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索，或者直接使50mg/kg的濃度進(jìn)行測(cè)試。

注射方式:依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)而定，如腹腔注射，皮下注射，肌肉注射，尾靜脈注射等，其中以腹腔注射為多。6小時(shí)后或根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)確定適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，快速處死小鼠，取出所需組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標(biāo)記的時(shí)候也可參考相關(guān)文獻(xiàn)自行調(diào)整。

建議任何實(shí)驗(yàn)均可取小腸組織檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，小腸上皮組織細(xì)胞增殖快，成年小鼠EdU注射6小時(shí)后即可檢測(cè)到陽(yáng)性信息，可用作陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

切片處理

切片前處理：組織器官最好進(jìn)行清洗，以去除血液、組織中殘留的EdU，降低背景。

切片厚度：3-10μm為宜，切片過厚可能會(huì)影響切片背景及染色效率。

切片后處理：

石蠟切片脫蠟：二甲苯脫蠟2次，15分鐘/次，梯度乙醇（100%，95%，85%，75%）各一次，5分鐘/次，去離子水洗脫1次。

冰凍切片處理：室溫放置30分鐘后，固定10分鐘，PBS清洗3次，每次5分鐘。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞 EdU標(biāo)記

用細(xì)胞完全培養(yǎng)基和EdU母液按8000：1的比例稀釋，制備適量50μM的EdU培養(yǎng)基；

每孔加入適量50μM的EdU培養(yǎng)基孵育2小時(shí)，棄培養(yǎng)基（最佳孵育時(shí)間一般為細(xì)胞周期的1/10）,PBS清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，EdU培養(yǎng)基和EdU反應(yīng)液孵育體積可參考下表；

	96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板	5.5cm小皿
EdU培養(yǎng)基	100μL	200μL	300μL	500μL	1mL	2mL
EdU反應(yīng)液	100μL	200μL	300μL	500μL	1mL	2mL

細(xì)胞固定通透

每孔加入細(xì)胞固定液（含4%的多聚甲醛的PBS）室溫孵育15分鐘，棄固定液，PBS 清洗3次，每次5分鐘；

每孔加入滲透劑(0.5%TritonX-100 的 PBS)脫色搖床孵育15分鐘；PBS 清洗3次，每次5分鐘。

Edu反應(yīng)

按照PB：CU：AC：色原=860：40：100：5的比列配制EdU反應(yīng)液（反應(yīng)液現(xiàn)配現(xiàn)用）。

每個(gè)樣本滴加50-100μL的EdU染色反應(yīng)液（反應(yīng)液均勻覆蓋樣本），室溫避光孵育15-60分鐘，棄染色反應(yīng)液，PBS沖洗3次，每次5分鐘。

DAPI染色

每片組織加入50-100ul DAPI染色液，染色15分鐘，PBS洗脫三次，每次5分鐘。

圖像拍照

染色完成后建議立刻觀察，使用熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡或者全片掃描儀進(jìn)行采集圖像，染色完玻片避光4℃保存。

實(shí)驗(yàn)前須知

EdU 的分子量為 252.23，易溶于水、PBS、生理鹽水。對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，如使用自備EdU粉末，建議將 EdU 粉末溶解于DMSO配制成 100mg/ml的母液。EdU建議初始給藥量為50mg/kg（50μg/g），稀釋濃度為 0.5~1mg/mL。小鼠體重20g，需要注射1mg，以1mg/mL計(jì)算，需要注射1mL。

Edu	0.1mg	1mg	2mg	10mg
PBS	100μL	1mL	2mL	10mL

對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，EdU母液質(zhì)量濃度為100mg/mL，轉(zhuǎn)化為物質(zhì)的量濃度為400mM，待使用時(shí)用細(xì)胞完全培養(yǎng)基和EdU母液按8000：1的比例稀釋，制備適量50μM的EdU培養(yǎng)基（50μM為推薦濃度。由于細(xì)胞類型、培養(yǎng)基種類、細(xì)胞密度和增殖速度等多種因素會(huì)顯著影響EdU在細(xì)胞中的摻入量。因此，在首次使用EdU時(shí)，建議對(duì)其使用濃度進(jìn)行一些探索和調(diào)整。如果您之前已經(jīng)使用BrdU進(jìn)行過實(shí)驗(yàn)，可以將BrdU的終濃度作為EdU的參考濃度）。

【注意事項(xiàng)】

1. 對(duì)于體外培養(yǎng)細(xì)胞，具體 EdU 使用濃度、孵育時(shí)間隨樣品以及研究目的的不同，可進(jìn)行 適當(dāng)調(diào)整。

2. 部分組織細(xì)胞增殖速度緩慢，為了排除造模效果不佳等因素，建議選增殖快的組織樣品作 為參照樣本 (如腸道組織)

3. 如果背景顏色過深，可能是實(shí)驗(yàn)中洗滌不充分、組織樣品固定時(shí)間過長(zhǎng)、固定液殘余導(dǎo)致。

4. 催化劑 AC 顏色發(fā)生輕微變化，點(diǎn)擊反應(yīng)催化體系依舊能夠正常進(jìn)行，如呈現(xiàn)棕色，表明 該組分已失效，請(qǐng)棄用。

5. 操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，佩戴一次性手套。